ANA SAYFA

Uz. Dr. Ercan ÖZTÜRK ( Biyokimya )

ercanozturk@klinisyen.com

BİYOKİMYA'DA BİLİNMESİ GEREKEN BAZI TEMEL YÖNTEMLER

Tüm kursiyer arkadaşların en çok merak ettiği şeylerden birisi, son sınavlarda yöntemler çok soruluyor. Bu konuda ne yapabiliriz? Sonuçta tüm laboratuar yöntemlerini öğrenmek hem çok zor, hem de gereksiz. Ben bu baskıda önemli gördüğüm bazı temel yöntem ve testlerle ilgili bilinmesi gereken bazı bilgileri eklemeye çalıştım.

Total Protein; Serumda total protein miktarı 6,0 - 8,0 gr/dl dir. Total protein ölçümünde başlıca yöntemler aşağıda verilmiştir.

Bu yöntemleri anlatmadan önce bazı temel prensipleri incelemek gerekir.

Kolorimetri; Bir ışık kaynağından çıkan, gözle görülen (350-780 nm dalga boyunda) ışığın renkli bir çözelti içerisinden geçerken, oluşturduğu absorbansın ölçülmesi prensibidir.

Fotometri; Kolorimetri prensibi ile aynı olup, temel fark 200 ila 2000 nm dalga boyu arasındaki, yani UV ve İnfrared ışınların da kullanılmasıdır. Kolorimetre ve fotometrede yukarıda verilen dalga boyu aralıklarında ışık geçiren belirli sayıda sabit filtreler kullanılır.

Spektrofotometre; Fotometre ve kolorimetre cihazlarından daha gelişmiş olup, istenilen tek bir dalga boyunda ışık bir prizma aracılığıyla % 1 hassasiyet ile seçilebilmektedir ( örn 280, 281, 282,….. nm vb ).

Florometri; Belirli bir ışık kaynağından çıkan UV ışık, çözelti içindeki maddeler tarafından absorbe edilerek daha uzun bir dalga boyu ( görünür ışık ) şeklinde yayımlanırsa buna floresans denir. Floresansı ölçen cihazlara fluorometre denir.

Direkt fotometrik ölçüm; Proteinlerin yapısında bulunan triptofan ve tirozin gibi aromatik aminoasitlerin pH 8 de ultraviole dalga boyunda ( 280 nm ) verdiği absorbansın spektrofotometrik ölçümüne dayanır.

Biüret yöntemi; Bu yöntem, proteinlerin yapsındaki peptid bağlarının, alkali çözeltide +2 değerlikli bakır ile verdiği rengin, spektrofotometrik ölçümüne dayanmaktadır.

Kjeldahl yöntemi; Proteinlerin yapısındaki azotun amonyum iyonuna dönüştürülerek total nitrojen ölçülmesi prensibine dayanmaktadır.

Folin-ciacaltu ( fenol ) ayıracı ile Lowry yöntemi; Proteinlerin yapsındaki tirozin ve triptofanın fosfotungusto-molibdik asit ile reaksiyona girerek verdiği mavi rengin ölçülmesi prensibine dayanır.

Türbidimetri; Proteinlerin, sülfosalisilat veya TCA (triklo-asetisikasit) gibi maddelerle oluşturduğu bulanıklığın içinden geçen ışığın, absorbansının ölçümüne dayanmaktadır.

Nefelometri; Proteinlerin, sülfosalisilat veya TCA (triklo-asetisikasit) gibi maddelerle oluşturduğu bulanıklığa çarparak yansıyan ışığın ölçümüne dayanmaktadır.

İmmuno kimyasal yöntemler; Antijenle antikor birleşmesi spesifiktir. Erimiş bir antijen kendisine karşı hazırlanmış bir antikorla eşit oranlarda karşılaştırılırsa bir çökelme meydana gelir. Bu olaya presipitasyon denir. Bu yöntemle protein, antijen ve antikor miktarı tayin edilebilir.

Başlıca immunokimyasal yöntemler; Radial immundiffüzyon (RİD), Radio immunölçüm (RİA), Radyoreseptör ölçüm (RRA), Floroimmun ölçüm (FİA), Kemilüminesans ölçüm, Enzim bağlı immuno absorbent ölçüm (ELİSA), İmmunelektroforez olarak sayılabilir.

Albümin ölçümü;

Albümin ölçümünde klasik yöntem, Bromkrezol yeşili (Bromcresol green BCG) gibi anyonik boyalarla pH 4,2 de albüminin bağlanması ve verdiği absorbansın 628 nm de spektrofotometrik ölçümüdür.

Amonyak ölçümünde dikkat edilecek noktalar;

1. Sigara içiminden en çok etkilenen parametre amonyaktır. Sabah numune alınacak hasta gece yarısından itibaren sigara içmemelidir. Sigara içen hasta testten önce duş almalı, temiz pijama giymelidir. Kanı alan teknisyen sigara içmeyen biri olmalı.

2. Laboratuvar ortamı ve cam malzemelerde amonyak kontaminasyonu olmamalı,

3. Kan alma sırasında, venin palpe edilerek aranmaması gerekir, kan alımı sırasında örneğin hava ile teması olmamalı,

4. Örnek içerisindeki azotlu maddeler yıkılarak amonyağa dönüşebilir, dolayısı ile numune alınır alınmaz buz dolu bir kaba alınmalıdır. En geç 15 dakika içinde santrifüj edilerek en kısa sürede çalışılmalıdır.

Bilirubin ölçümü; Klasik yöntem Ehrlich ayıracı da denilen diazolanmış sülfirik asitin ( Diazo reaktifi ) bilirubinle reaksiyona girmesi ile oluşan azopirolün alkollü ortamda ölçülmesi ile total bilirubin bulunur. Aynı test, alkolsüz ortamda yapınca direkt bilirubin ölçülür. Sonuç olarak total bilirubinden, direkt bilirubin çıkarılırsa indirekt bilirubin hesaplanmış olur. Bilirubin ışıktan kolay zarar görür, en kısa sürede çalışılmalıdır. Serum bekleyecekse karanlık bir yerde saklanmalıdır.

Kreatinin ölçümü; Klasik yöntem Jaffe reaksiyonudur. Burada alkali ortamda kreatinin’in pikrik asitle verdiği turuncu-kırmızı rengin spektrofotometrede ölçümü esastır.

ÜRE (“BUN”): Birçok laboratuvar üre içindeki nitrojeni ölçerek BUN sonucu vermektedir. Bu nedenle üre ve BUN arasındaki ilişkinin bilinmesi önemlidir. Üre molekül ağırlığı 60 olan ve içinde iki adet nitrojen bulunduğundan 60 gr ürenin 28 gr’ı azottan gelir. (60/28=2,14)

Bu ilişki: Üre = BUN X 2.14 olarak formüle edilir.

Serumda total kolesterol ölçümü;

Serumda total kolesterol, Lieberman-Buchard yöntemi de denilen, asetik asit, asetik anhidrit ve sülfirik asit karışımının, kolesterol ile reaksiyona girerek verdiği yeşil rengin 620 nmde spektrofotometrik ölçümü ile çalışılır.

HDL kolesterol ölçümü; Apo B içeren lipoproteinler ( VLDL, LDL ) dekstransülfat-magnezyum klorür gibi polianyonlar ve sülfatlanmış polisakkaridler ile reaksiyona girerek çökerler. Eğer serumu dekstransülfat – magnezyum klorür kullanarak çöktürür ve 3000 devirde 30 dakika çevirdikten sonra, süpernatandan lieberman-buchard yöntemi ile kolesterol çalışırsak HDL tayin edilir.

VLDL Kolesterol; Serumda ölçülen Trigliseridin 1/5’ i VLDL dir ( Trig/5 = VLDL)

LDL kolesterol düzeyi Friedwald formülü ile hesaplanır

LDL = Total kolesterol - [ HDL + (Trigliserid/5)]

* Burada unutulmaması gereken, bu formül trigliseridler 400 mg/dl fazla ise uygulanamaz.

Ürik asitin ölçümü; Klasik yöntem, üratın alkali ortamda fosfotungustik asit ile reaksiyona girerek oluşturduğu mavi rengin (tungsten mavi) 670 nmde spektrofotometrede çalışılmasıdır.

Plazma ile serum arasındaki farklar:

Serum, antikoagülan içermeyen düz tüpten elde ediliği için fibrinojen gibi pıhtılaşma faktörlerini içermezken, plazmada fibrinojen bulunur. Ayrıca bilirubin, kolesterol ve kreatinin dışında bir çok maddenin plazma ve serum konsantrasyonları farklılık gösterir.

Umarım yukarıdaki bilgiler işinize yarar. Sınavda her şeyin gönlünüzce olmasını dilerim. Başarılar…